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DNA-Analyse

Molekularbiologischer Hintergrund:

Ausgangspunkt der DNA-Typisierung ist das doppelsträngige, fadenförmige Molekül - DNA (engl.: Desoxyribonucleicacid; bzw. deutsch: DNS: Desoxyribonukleinsäure), die in jedem Zellkern enthalten und Träger der vollständigen genetischen Information eines Individuums ist. Die DNA ist mit Hilfe von Histonen zu Chromosomen komprimiert. Sie ist zusammengesetzt aus Nukleotiden, die aus vier Basen, Adenin, Cytosin, Guanin und Thymin, sowie aus einer Phosphatgruppe und einem Zuckermolekül, bestehen. Durch eine spezifische Abfolge der Nukleotide, die so genannte Basensequenz, ist die genetische Information codiert. Die Nukleotide sind im Doppelstrang komplementär zueinander, das heißt, Adenin und Thymin sowie Cytosin und Guanin passen zueinander (siehe Bild).

Die für den genetischen Fingerabdruck erforderliche DNA findet sich in allen kernhaltigen Zellen, wie beispielsweise in den Leukozyten (weiße Blutkörperchen), Körpergewebe, Sperma, Knochen oder Vaginalzellen.
Die menschliche DNA besteht nur aus einem geringen Anteil an Genen. Es handelt sich hierbei um die Bereiche, die die Erbinformation tragen, den so genannten codierten Bereich der DNA, den Exons, die nur ca. 5 % der DNA belegen. Der Rest, also ca. 95%, ist nicht codierter Bereich ohne (bis jetzt bekannte) spezielle Funktion, auch „genetischer Mörtel“, Nonsens-DNA oder Introns genannt.

Einige dieser Introns können sich durch bestimmte Einflüsse verändern bzw. mutieren, ohne Folgen für den Phänotyp. Diese individuellen Merkmalsysteme sind vor allem für kriminaltechnische Auswertungen von Bedeutung. Die nicht-codierten Abschnitte sind von Mensch zu Mensch unterschiedlich lang (= variabel), aber innerhalb einer Person liegen keinerlei Längenunterschiede vor, da die DNA in allen Körperzellen gleich ist. Die Exons sind sozusagen in die Introns eingebettet. Diese nicht-codierten Abschnitte besitzen eine bestimmte Reihenfolge von Basen (entspricht einer Sequenz), die sich mehrmals wiederholen kann. Es gibt hunderte solcher DNA-Abschnitte, die sich nach Längeneinheiten in Minisatelliten und Mikrosatelliten (= STR´s) einteilen lassen. Heutzutage werden in der Kriminaltechnik nur noch STR´s angewandt, die so genannten Short Tandem Repeats. Wie der Name schon sagt, bestehen sie aus kurzen, ca. 2-4 Basen langen und sich immer wiederholenden DNA-Abschnitten. Von mehr als 100 repetetiven DNA-Abschnitten hat man sich in der Kriminalistik mittlerweile auf ca. 30-40
geeignet, die in der Population sehr variabel sind. Diese Genorte, auch Loci genannt, nennt man VNTR-Loci (Variable Numbers of Tandem Repeats).
(vgl. Benecke, 1999, S 56;)

Isolierung der DNA aus der Probe:

Im Labor wird die DNA (z.B. vom Tatort) mit Hilfe von Detergentien (z.B. SDS) aus den Zellmembranen gelöst und dann gereinigt.

DNA-Isolierung am Beispiel einer Zwiebel:

Zutaten zur DNA-Isolierung aus einer Zwiebel: Spülmittel, Kochsalz, Wasser, 1 Zwiebel, Protease (Waschmittel), Alkohol (Ethanol)

Herstellung einer Lösung aus Spülmittel, Kochsalz und Wasser

Salzige Spülmittellösung mit klein geschnittener Zwiebel mischen: Das Spülmittel bricht die Zellmembranen auf, so dass die DNA aus den Zellen und Zellkernen frei wird.

Warmes Wasserbad: 15 min. bei ca. 60°C: Wärme beschleunigt den Prozess und zerstört DNAsen, Enzyme, welche die DNA abbauen können.

Kaltes Wasserbad: Zu lange Wärmebehandlung würde auch die DNA schädigen. Durch das kalte Wasserbad wird dieses verhindert.

Zwiebel vorsichtig zu einem körnigen Mus zerquetschen um die restlichen Zwiebelzellen aufzuschließen.

Mischung filtern: Dieser Schritt trennt die Zellwandbestandteile von der DNA und den Proteinen, die nun im Filtrat gelöst sind.

Waschmittel zu der gefilterten Lösung geben und gut mischen: Im Waschmittel ist das Enzym Protease enthalten, welches die restlichen Proteine in der Lösung abbaut.

Das leicht schaumige Extrakt wird mit kaltem Ethanol überschichtet. Die DNA setzt sich im Ethanol ab.

Die DNA fällt schlierenartig in der Alkoholphase aus.

RFLP-Methode:

Grundsätzlich unterscheidet man im Groben zwei verschiedene Methoden, zum einen die klassische aber veraltete RFLP-Methode (bis ca. 1992) und zum anderen die verbesserte Variante, die so genannte VNTR-Typisierung auf der Basis der PCR-Technik.
Für die RFLP-Methode (Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus) benötigt man bis zu 20 Kilobasen lange DNA, die mit Hilfe von Endonucleasen
(= proteinauflösende Substanz) aus den Zellen isoliert werden.Um die Längenunterschiede (Polymorphismen) zu ermitteln, behilft man sich mit Restriktionsenzymen, auch „molekulare Scheren“ genannt, die die DNA an bestimmten Sequenzen in unzählige DNA-Stücke der Länge nach zerlegen (= Verdau). Um diese vielen DNA-Fragmente der Größe nach zu sortieren, wird die Gelelektrophorese angewandt. Im Gleichspannungsfeld einer Agarosegel-Elektrophorese wandern die DNA-Fragmente mit ihrer natürlichen negativen Ladung, in einem Streifen der Länge nach sortiert auseinander zum Pluspol, wobei die kürzeren Fragmente am schnellsten wandern. Anschließend werden die doppelsträngigen DNA-Fragmente mit Hilfe einer alkalischen Pufferlösung in Einzelstränge denaturiert (aufgespalten). Danach werden diese mit Hilfe der „Southern-Blot“-Methode auf ein spezielles Nylonmembran übertragen (bzw. durchgezogen) und durch Wärme fixiert. Nach dem „blotting“ werden radioaktiv markierte, einsträngige Sonden-DNA auf das Nylonmembran gegeben, die so beschaffen sind, dass sie sich an einer oder mehreren Stellen (Sequenzen) der DNA hybridisieren (binden) können. Durch ihre komplementären Eigenschaften werden sie von den DNA-Fragmenten angezogen. (vgl. Benecke, 1999, S 60f)
Zum Schluss wird ein Kontaktabzug auf einem Röntgenfilm gemacht. Durch die radioaktive Strahlung färbt sich der Röntgenfilm genau an den Stellen, an denen sich die markierten DNA-Fragmente auf dem „Abklatsch“ hybridisiert haben. Zur Verdeutlichung siehe folgendes Bild, in dem der schematische Ablauf der RFLP-Methode vereinfacht dargestellt ist.

So entsteht das charakteristische, klassische Bandenmuster des genetischen Fingerabdrucks, wie im folgenden Bild, bei einem Vaterschaftstest, deutlich zu erkennen. In der linken Spalte liegt eindeutig ein Vaterschaftseinschluß bei ca. 4,9 kb vor. In der rechten Spalte findet sich keine Übereinstimmung des DNA-Profils vom Kind, mit dem des vermuteten Vaters. Somit ist hier eine Vaterschaft auszuschließen.


Die in der ersten Phase der DNA-Analytik verwendeten Sonden waren die so genannten Multilocus-Sonden. Wie der Name schon sagt, kamen hier viele Banden zur Ausprägung, die aber sehr schwer auszuwerten waren. Wegen weiterer Nachteile lag die Erfolgsquote nur bei 10-20%.
Die zweite Phase der DNA-Analytik begann mit der Untersuchung von Single-Locus-Systemen, bei denen 1-2 Fragmente pro Individuum nachzuweisen sind. Und somit stieg die Erfolgsquote der Spurenfälle auf ca. 30-40%. (vgl. Brinkmann/Wiegand, Heft 3/93, S.191f)
Auf Grund der Nachteile der RFLP, wie beispielsweise die hohe Anzahl der benötigten Menge an DNA, sowie die Probleme bei der statistischen Auswertung und dessen Fehleranfälligkeit, wird die RFLP heutzutage kaum noch benutzt.

PCR-VNTR-Typisierung:

Seit ca. 1992/1993 wurde die VNTR-Typisierung zunehmend angewandt. Als Grundlage dienen hier die STR-Systeme, auch Microsatelliten genannt, die sich durch sehr kurze Fragmentenlängen zwischen ca. 120 und 350 Basenpaaren auszeichnen. Es existieren etwa 30-40 Systeme mit Bezeichnungen wie TH01, D21S11, VWA/VWF, D3S1358, FIBRA, CE33, D8S1179, D18S51 (siehe folgendes Bild) mit den möglichen Längeneinheiten der acht gängigsten Microsatelliten; Amelogenin ist nur zur Geschlechtsbestimmung). Die Abkürzungen gehen zum einen auf Namen der STR´s benachbarter Gene zurück (bei VWA/VWF = der Von-Willebrand-Faktor). Andere Namen ergeben sich aus einer genetischen Nomenklatur, D21S11 liegt beispielsweise auf Chromosom 21 (D21) am „Kilometerstein“ 11 (S11).
(vgl. Brinkmann/Wiegand, 1993, S.192).


Da es äußerst umständlich wäre, die Längen der variablen Bereiche direkt auszumessen, behilft man sich der PCR-Technik. (vgl. Benecke, 1999, S. 68)
„Durch die PCR (Polymerase-Chain-Reaction) wurde eine neue Tür im Bereich der Spurenanalytik aufgestoßen.“ (Zitat: Brinkmann/Wiegand, 1993, S. 192)
Diese Methode ermöglicht eine gentechnologische Amplifizierung (Vervielfältigung) einzelner ganz bestimmter Genomabschnitte (Allele) um etwa ein Millionenfaches. Für die entwickelte Technik erhielt dessen Erfinder Kary Mullis 1993 den Nobelpreis für Medizin.
„Die PCR hat ihre Vorteile dort, wo die bisherigen Verfahren schwach waren.“
(Zitat: Brinkmann/Wiegand, 1993, S.192)


Bei der Polymerasekettenreaktion wird die DNA zuerst auf 95 °Celsius erhitzt, damit sich der Doppelstrang denaturiert. Anschließend gibt man Startermoleküle, so genannte Primer (kurze DNA-Einzelstränge) hinzu, die bei etwa 65°C an die Startsequenzen der zu kopierenden DNA andocken, da sie komplementär sind. Bei 72 °C wird das Enzym Polymerase aktiv. Es ergänzt ausgehend von den Primern jeden Einzelstrang zum Doppelstrang. (siehe obiges Bild)
Diese drei Schritte werden ungefähr 32 Zyklen lang wiederholt, bis genügend Kopien der gewünschtenDNA-Abschnitte zur DNA-Analyse (rund eine Milliarde) zur Verfügung stehen. (vgl. Dreifert, Internet, S. 2; Regenass-Klotz, 2000, S.66-69)
Mit der nun ausreichenden Menge an kopierten DNA-Abschnitten behilft man sich wieder, wie bei der RFLP, der Elektrophorese, um die variablen DNA-Fragmente der Länge nach aufzuteilen. Im Gleichspannungsfeld befindet sich nun Polyacrylamid-Gel, und die negativ geladene DNA wandert mit den kurzen DNA-Abschnitten voran zum Pluspol. Mit Polyacrylamid ist die Auflösung um einiges besser als mit Agarosegel. Anschließend wird das Gel mit einem Silbersalz-Färbemittel entwickelt und wie bei der RFLP-Methode werden die Banden durch schwarze Linien sichtbar. Um die Länge der DNA-Abschnitte zu ermitteln, lässt man ein Gemisch aus allen bisher bekannten DNA-Abschnitten, die so genannte Allelleiter (scherzhaft Allelcocktail genannt) im Gel mitlaufen. Nun muss man nur noch die unbekannten Stücke mit denen aus der Allelleiter vergleichen. Diejenigen, die auf derselben Höhe liegen, haben auch dieselbe Länge.
Mit Hilfe der PCR-Technik gewann die DNA-Analyse für die Kriminalistik immer mehr an Bedeutung, da bereits aus winzigsten biologischen Spuren mit 90%iger Erfolgsquote noch genügend DNA für eine DNA-Typisierung ausreichen. (vgl. Benecke, 1999, S 57f)

Auswertung eines genetischen Fingerabdrucks heute

Die Längenbestimmung der PCR-Produkte wird heute überwiegend mit der so genannten Kapillar-Elektrophorese durchgeführt (siehe folgende Bilder). Bei dieser Technik werden nicht nur 24 Proben gleichzeitig auf ein Gel aufgetragen, sondern eine Probe nach der anderen in einer Glaskapillare, die mit einem gelartigen Medium befüllt ist, aufgezogen. Das Gerät ist somit in der Lage, selbständig bis zu 96 Proben abzuarbeiten. Somit wurde die Kapazität der untersuchenden Laboratorien vervierfacht. Bei dieser Methode werden die Primer bereits bei der PCR fluoreszenzmarkiert. Anschließend erfolgt die Elektrophorese durch die Glaskapillare, und wenn die mit Fluoreszenz markierte DNA vom Argonlaser gescannt wird, ermittelt dieser auf Grund der Zeit (oder Wegstrecke) die Länge des DNA-Stücks. Die Daten werden danach gleich an einen Computer weiter gesandt und ausgewertet.

Das Ergebnis wird in Form einer Grafik und dessen Interpretation in einer Tabelle gespeichert (siehe folgende Bilder). Das charakteristische DNA-Bandenmuster gehört somit der Vergangenheit an.
(Dr. Anslinger, Gerichtsmedizin München 10/02)

Eine weitere Entwicklung der DNA-Typisierung die noch zuverlässiger sein soll, sind SNP-Marker, die einzelne Basen austauschen können. Diese Methode wird im Moment hauptsächlich nur in der medizinischen und tiermedizinischen Forschung angewandt. Da sich diese Methode als noch sicherer bewährt hat, wird sie jetzt im Anfangsstadium auch in der Forensik angewandt. (Dr. Buitkamp, BLT in Grub)